«Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения На проведение экспериментов было получено разрешение этического комитета ГБОУ ВПО ДВГМУ


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
На правах рукописи






Пинаева Ольга Геннадьевна



СТРУКТУРНО
-
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТО
ЯНИЕ ПЕЧЕНИ

БЕЛЫХ КРЫС, ПОДВЕРГН
УТЫХ АНТЕНАТАЛЬНОЙ Г
ИПОКСИИ,

И КОРРЕКЦИЯ ВОЗНИКАЮ
ЩИХ НАРУШЕНИЙ

АНАЛОГАМИ ЛЕЙ
-
ЭНКЕФАЛИНА




14.03.03


патологическая физиология



Авторе
ферат
д
иссертаци
и

на соискание ученой степени кандидата
медицинских наук






Благовещенск



201
8

��2
Работа выполнена в
федеральн
государственном
бюджетном
образовательном
учреждени
высшего образования «Дальневосточный государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской
Федерации.
Научный руководитель
:
доктор медицинских наук, доцент
Сазонова Елена Николаевна
Официальные оппоненты:
Меньщикова Елена Брониславовна,
доктор медицинских наук
,
федеральное
государственное бюджетное
научное учреждение «Научно
исследовательский
институт экспериментальной и клинической медицины», руководитель
лаборатории
молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов
.
Надеев Александр Петрович,
доктор медицинских наук, профессор
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
образования «Новосибирский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации,
заведующий кафедрой
патологической анатомии
.
Ведущая организация
:
федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт
экспериментальной медицины»
Защита состоится «
мая»
8
года в
13:00
часов
на заседании объединенного диссертационного совета Д 999.
199.02
на базе
федерального государственного бюджетного научного
учреждения
«Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания»
федерального государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего образования «Амурская государственная медицинская академия»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
по адресу
675006,
Амурская область, г. Благовещенск, ул. Горького, д. 95
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального
государственного бюджетного научного учреждения «Дальневосточный
научный центр физиологии и патологии дыхания»
,
https://cfpd.amursu.ru/
Автореферат разослан «__
»__
________________201
года
Ученый секретарь
диссертационного совета
Приходько Анна Григорьевна
3

О
БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Кислородная недостаточность является основным повреждающим
фактором в системе «мать
-
плацента
-
плод» (Мешкова Е.М. и соавт., 2014).

Большинство осложнений беременности ассоциировано с
гипоксией

пло
да
(Евсеенко Д.А., Ещенко Ю.В., 2002)
.
Частота гипоксии плода и асфиксии в
родах, по данным разных авторов, составляет от 4% (Никольская Л.А., 1999) до
46,6% (Шарапова О.В., 2003). Антенатальная гипоксия (АНГ) и асфиксия при
рождении занимают первое место
в структуре причин перинатальной
смертности (
Стародубов В.И. и соавт., 2012
;
Фролова О.Г. и соавт., 2012
).

АНГ
в анамнезе осложняет течение постнатальной адаптации новорожденного
ребенка (Евсеенко Д.А., Ещенко Ю.В., 2002;
Malhotra

A
.

al
., 2017
;
Wang K.C
.

al
., 2017
).

Печень обладает высокой чувствительностью к недостатку кислорода,
уступая в этом отношении лишь головному мозгу (Подымова С.Д., 2005).
Гипоксия
плода приводит к повреждению печени (
Надеев А.П. и соавт., 2014
;
Hannam S.

al
., 2003
). Хр
оническая АНГ является фактором риска длительно
й

гипербилирубинемии (Мехрякова И.А., 2008) и коагулопатии новорожденных
(Балдина Н.Ю., Спичак И.И., 2014;
Hannam

S


al
., 2003
).

Последствия
АНГ
могут иметь место не только в перинатальном периоде,
но и в бо
лее поздние сроки онтогенеза млекопитающих (Кельмансон И.А.,
1999
;

Маслова М.В. и соавт., 2001;
Li

G


al
., 2003;
Kappeler

L
.

al
., 2017
;
Wang K.C.

al
., 2017
). Это соответствует концепции «фетального
программирования» (
Hales

C
.
N
.,
Barker

D
.
J
., 1992). У детей, перенесших АНГ,
в препубертатном и пубертатном возрасте нередко диагностируется
неалкогольный гепатоз
(
Бокова Т. А., Урсова Н.
И. 201
1;
Fu

J
.
F
.

al
., 2011;
Gupta

R
.
, 201
1
).
Дети с перенесенной
перина
тальной гипоксией подлежат
диспансерному учету как больные с функциональными нарушениями
гепатобилиарной системы (Вахитова Л.Ф., 2004; Бережанская С.Б. и соавт.,
2013
).

4

Вместе с те
м, связь отдаленных структурно
-
функциональных нарушений
печени и
окислительного

стресса, обусловленного АНГ, изучена недостаточно.
Данные о возможных путях коррекции патологии печени, связанной с АНГ,
немногочисле
н
ны
(
Wesolowski

S
.
R
.
.
al
., 2017
).

Сведен
ия о возможности
использования биологически активных пептидов в постнатальной коррекции
патологии печени после АНГ носят единичный и несистематизированный
характер.

В связи с этим,
целью

исследования было изучение
морфофункционального состояния печени белы
х крыс, подвергнутых
антенатальной гипоксии, а также возможност
ь

коррекции постгипоксических
нарушений аналогами лей
-
энкефалина.

Задачи исследования:

1.

Изучить
ДНК
-
синтетическую активность, количество ядрышек
гепатоцитов и показатели свободноради
кального оки
сления гомогенатов
печени 7
-
суточных
белых крыс
, подвергнутых антенатальной гипоксии.

2.

Изучить
цитокариометрические параметры

гепатоцитов,
показатели
св
ободнорадикального окисления и
биохимичес
кие маркеры повреждения
печени

60
-
суточных
белых крыс
, подвергну
тых антенатальной гипоксии.

3.

Исследовать ДНК
-
синтетическую активность, количество ядрышек
гепатоцитов 7
-
суточных белых крыс и
цитокариометрические параметры

гепатоцитов
60
-
сут
очных белых крыс, подвергнутых
неонатальному введению
аналогов лей
-
энкефалина.

4.

Изу
чить влияние неонатального введения аналогов лей
-
энкефалина

на ДНК
-
синтетическую активность, количество ядрышек гепатоцитов и
показатели свободнорадик
ального окисления гомогенатов
печени 7
-
суточных
белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии.

5.

Изучить
влияние неонатального введения аналогов лей
-
энкефалина

на
цитокариометрические
параметры гепатоцитов и показатели
свободнорадикального окисления гомогенатов печени 60
-
суточных белых
крыс
,
подвергнутых
антенатальн
ой

гипокси
и.

5

6.

Провести сравнительный анализ

эффектов аналогов лей
-
энкефалина: агониста δ
-

-
опиатных рецепторов (пептида
даларгин) и
неопиатного аналога лей
-
энкефалина (пептида НАЛЭ).

Научная новизна
.
Впервые изучены отдаленные эффекты
гипоксического воздействия в антенатальном периоде на
цитокар
иометрические показатели гепатоцитов и свободнорадикальные
процессы в печени половозрелых белых крыс. Выявлено, что у половозрелых
животных, перенесших антенатальную гипоксию, имеет место снижение массы
печени, уменьшение размеров гепатоцитов и их ядер, сн
ижение количества и
размеров ядрышек. Впервые показано, что структурные нарушения в печени
половозрелых животных, перенесших антенатальную гипоксию,
сопровождаются
окислительным

стрессом на органном и организменном
уровнях.


Впервые изучены эффекты неонат
ального введения неселективного
агониста δ
-

-
опиатных рецепторов

(ОР)

даларгина и неопиатного аналога лей
-
энкефалина пептида НАЛЭ на ДНК
-
синтетическую активность и количество
ядрышек гепатоцитов 7
-
суточных белых крыс, а также на
цитокариометрические парам
етры
гепатоцитов
60
-
суточных

белых крыс.

Впервые проведен анализ гепатопротективного эффекта неонатального
введения неселективного агониста δ
-

-
ОР

даларгина и неопиатного аналога
лей
-
энкефалина пептида НАЛЭ у 7
-

и 60
-
суточных белых крыс, перенесших
антен
атальную гипоксию. Показано, что неонатальное введение аналогов лей
-
энкефалина оказывает корректирующее влияние на пролиферативную и
анаболическую активность гепатоцитов, а также свободнорадикальное
окисление в ткани печени белых крыс, подвергнутых антенат
альной гипоксии.

Теоретическая и практическая значимость работы
.
Исследование
проводилось в рамках
Г
осударственного задания № 056
-
00110
-
16
-
00 ПР

«Роль регуляторных пептидов группы опиоидов в компенсации нарушений
структурного гомеостаза организма, индуцир
ованных антенатальным
оксидативным

стрессом».

Полученные экспериментальные данные дополняют
6

современные представления о патогенезе ранних и отдаленных
морфофункциональных нарушений печени у млекопитающих, перенесших
антенатальную гипоксию; а также о влияни
и биологически активных пептидов
на морфофункциональное состояние печени в физиологических условиях и в
условиях патологии.

Показана возможность коррекции нарушений ядрышкового аппарата
гепатоцитов и процессов свободнорадикального окисления после
антенатал
ьной гипоксии с помощью неонатального введения аналогов лей
-
энкефалина, что может быть использовано при определении показаний к
применению лекарственных препаратов, созданных на основе исследованных
пептидов.

Дано экспериментальное обоснование перспективн
ости применения
фармакологических препаратов на основе неопиатного аналога лей
-
энкефалина
при патологических состояниях новорожденных, индуцированных
антенатальной гипоксией.

Полученные экспериментальные данные могут быть использованы для
чтения лекций и
проведения практических занятий по дисциплинам
«Патологическая физиология», «Общая патология», «Фармакология» в ВУЗах
медицинского и биологического направления.

Методология и методы исследования
.
Для анализа влияния

антенатальной гипоксии на структурно
-
фун
кциональное состояние печени
новорожденных и половозрелых

белых крыс, а также возможностей
коррекции
возникающих изменений пептидами даларгин и НАЛЭ
,

проводили
авторадиографическое
,
гистохимическое
,
морфометрическое исследования

гепатоцитов. ДНК
-
синтетиче
скую активность гепатоцитов изучали

методом
авторадиографии с
3
Н
-
тимидином. Параметры ядрышкового организатора
исследовали с помощью морфометрии гистологических и цитологических
препаратов, окрашенных по методу AgNOR. Свободнорадикальные процессы в
гомоген
атах печени и сыворотке крови изучали методом хемилюминесценции.
Функциональное состояние печени оценивали с помощью биохимических
7

показателей сыворотки крови
и иммуноферментного анализа активности
аргиназы
-
I
. Статистическую обработку полученных экспери
ментальных
данных осуществляли с помощью программы
Statistica

10.0.

Степень достоверности
.
Научные положения и выводы обоснованы
достаточным объемом выполненных исследований с использованием
современных методов, сертифицированных оборудования и реактивов.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью
пакета современных статистических компьютерных программ.

Основные п
оложения, выносимые на защиту
:

1.

Антенатальная гипоксия вызывает снижение ДНК
-
синтетической
активности и угнетение ядрышк
ового аппарата гепатоцитов на фоне активации
свободнорадикальных процессов в печени новорожденных белых крыс.

2.

У половозрелых белых крыс, подвергнутых антенатальной
гипоксии, име
ю
т

место снижение цитокариометрических параметров
гепатоцитов и активация про
цессов свободнорадикального окисления в ткани
печени.

3.

Неонатальное введение аналогов лей
-
энкефалина оказывает
корректирующее влияние на пролиферативную и анаболическую активность
гепатоцитов, а также свободнорадикальное окисление в ткани печени белых
крыс,

подвергнутых антенатальной гипоксии.

Апробация работы.
Материалы исследования были представлены и
обсуждены на

Межрегиональной научно
-
практической конференции по
лабораторной диагностике (Хабаровск, 2013); на
I

Межрегиональной научной
конференции «Актуал
ьные вопросы экспериментальной биологии и медицины»
(
Хабаровск,
2013
); на II Межрегиональной научной конференции
«Актуальные
вопросы экспериментальной биологии и медицины»
(Хабаровск, 2014); на II
I

Межрегиональной научной конференции
«Актуальные вопросы
эк
спериментальной биологии и медицины», посвященной памяти профессора
С.С.Тимошина
(Хабаровск, 2015); на
II

Всероссийской научно
-
практической
конференции «Состояние и перспективы медицинской реабилитации» (Cанкт
-
8

Петербург, 2016), на VI Ежегодной Международно
й Научно
-
Практической
Конференции «Актуальные вопросы медицины» (Баку, 2017);
на
международном симпозиуме «Health Sciences University of Hokk
aido
Symposium» (Sapporo, 2017),

на

Дальневосточной научно
-
практической
конференции с международным участием

«Актуа
льные вопросы неонатологии
и педиатрии»

(Хабаровск, 2017).


Личный вклад автора
.
Личный вклад автора состоит в
непосредственном участии на всех этапах работы в форме

планирования
экспериментов (85

%), их непосредственного выполнения (95%), обработки
получе
нных данных (95%), обсуждения результатов (85%), написания статей и
тезисов (85%), написание диссертации и автореферата (85%).

Публикации
.
По теме диссертации опубликовано
1
3

печат
ных работ,
из
них
-

4

в изданиях,

рекомендованных ВАК Mинистерства образован
ия и науки
Российской Федерации, оформлено 1 рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации
.

Диссертация изложена на
1
5
1

страницах
, содержит

21 таблицу и 12 рисунков. Список литературы включает
38
9

источников
, в том числе
20
2

отечественных
и 18
7

иностранных. Работа
состоит из введения, обзора литературы, описания мате
риалов и методов
исследования, трех

глав собственных данных, заключения, выводов и списка
литературы.


ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

исследования

При постановке
опытов руководствовались приказом МЗ РФ № 267 от
19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». На проведение
экспериментов было получено разрешение этического комитета
ГБОУ ВПО
ДВГМУ Минздравсоцразвития России
.

3
-
4
-
х месячных
беременных
крыс
-
с
амок
с 14 по 19 сутки гестации
помещали в
экспериментальную гипобарическую камеру
, в которой создавали
давление

224 мм
.
рт.ст.
, что соответствует парциальному давлению

кислорода


42 мм
.
рт.ст.


Ежесуточная экспозиция составляла 4 часа.

И
с
следовали

9

потомство

подопытных крыс
-
самок, перенесших гипоксическое воздействие.
Контролем служило потомство интактных
животных.
Для изучения
возможности
коррекции последствий АНГ
,

потомству с 2 по 6 сутки жизни
ежесуточно в дозе 100 мкг/кг внутрибрюшинно
вводили
пептид
ные а
налоги
лей
-
энкефалина
:
неселективный агонист δ/µ
-
ОР
даларгин [Tyr

D
-
Ala

Gly

Phe

Leu

Arg] и неопиатн
ый

аналог лей
-
энкефалина НАЛЭ [Phe

D
-
Ala

Gly

Phe

Leu

Arg]

(
«
Алмабион
», Россия)
. Контрольные животные получали
эквиобъемное количество растворителя


физиолог
ического

раствора хлорида
натрия.
Потомство
г
ипоксированных крыс
-
самок

было разделено на
три
группы
:
«Антенатальная гипоксия»

(«АНГ»)
, «Антенатальная
гипоксия+
д
аларгин»

(АНГ+д
аларгин»)
, «Антенатальная гипоксия+НАЛЭ»

(«АНГ+НАЛЭ»)
.

Для анализа влияния пептид
ов на интактном фоне формиро
вали группы
«Даларгин» и «НАЛЭ»
:

животным вводили исследуемые пептиды

с 2 по 6
сутки жизни ежесуточно в дозе 100 мкг/кг внутрибрюшинно.
Потомство
гипокси
рованных

и инта
ктных крыс
-
самок

выводили из эксперимента на 7
-
е и
60
-
е сутк
и жизни.

П
осле
декапитации
у 7
-

и 60
-
суточных крыс извлекали печень
,

у 60
-
суточных животных
также
производили забор крови
.

Фрагменты ткани для
исследования выделяли из
левой боковой доли

печени
.

П
риготовление
гистологических препаратов
осуществляли
по об
щепринятой методике.

Ц
итологически
е

препарат
ы
изолированных гепатоцитов

готовили
методом

щелочной диссоциации (Коган М.Е. и соавт., 1976)
, а также

по собственной
методике (рац
ионализаторское

предлож
ение

№ 2780). Для анализа
ДНК
-
синтетической активности
геп
атоцитов
,

7
-
суточным животным за 1 ч до
эвтаназии
внутрибрюшинно
вводили
3
Н
-
тимидин в дозе 1 мкКи/г массы тела
(удельная активность 84 Ки/моль).

Приготовление радиоавтографов
осуществляли по принятой в лаборатории методике с использованием
фотоэмульсии Ilf
ord (Великобритания).

ДНК
-
синтетическую активность
оцен
ивали путем подсчета индекса ме
ченых ядер (ИМЯ)
. Также подсчитывали
интенсивност
ь

метки (ИМ



среднее количество треков серебра над ядром
),
10

косвенно характеризующую скорость синтеза ДНК
.

Ядрышки
гепато
цитов
изучали
на срезах печени и цитологических
препаратах, окрашенных по методу AgNOR

(
Мамаев Н.Н. и соавт.,1989;
Коржевский Д.Э., 2010).

С помощью компьютерной морфоцитометрии н
а
анализаторе изображения «МЕКОС
-
Ц»
оценивали
площадь гепатоцитов,
площадь яд
ер и
суммарную площадь ядрышек гепатоцитов.

Т
акже оценивали
долю двуядерных
клеток

в популяции
гепатоцитов.

Процессы свободнорадикального окисления

(СРО)

в гомогенатах печени
и сыворотке крови
исследовали

методом

хемилюми
несценции

(ХМЛ)
.

Регистрацию ХМЛ ос
уществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B
«PERKIN ELMER». Сигнал стандартизировали с помощью встроенной
программы "Finlab".
О
предел
яли

параметр
ы

интенсивности спонтанного и
активированного свечения (
Владимиров Ю.А., 1991
;
Арутюнян А.В.,

2000
)
: Sсп


светосумм
а

за 1 минуту спонтанной ХМЛ, величина которой прямо
коррелирует с интенсивностью проце
ссинга свободных радикалов; H1


максимум

амплитуды быстрой вспышки Fe
2+
-
индуцированного свечения,
свидетельствующий о содержании
гидроперекисей липидов; Sинд
1



светосумм
а

за 2 минуты Fe
2+
-
индуцированной ХМЛ, отражающая

скорость
образо
вания перекисных радикалов; Н2


максимум амплитуды Н
2
О
2
-
индуцированного люминол
-
зависимого свечения, величина которого обратно
коррелирует с перекисной рез
истентностью субстрата;

Sинд
2


светосумм
а

за 2
минуты Н
2
О
2
-
индуцированной люминол
-
зависимой ХМЛ, величина которой
обратно коррелирует с активностью антиоксидантной системы защиты.
Интенсивность ХМЛ, измеренную в милливольтах, выражали в относительных
единицах.

И
с
следование

био
химических показателей сывор
о
тки крови
у 60
-
суточных животных
проводили по общепринятым методикам (Меньшиков
В.В., 1987)

с помощью полуавтоматического анализатора «Виталон
-
400+» с
использованием био
химических наборов «Витал» (Рос
сия).

И
м
м
уноферментное
иссл
едование активности аргиназы
-
I

проводили твердофазн
ым

иммуноферментн
ым

метод
ом

(набор Rat

Arginase
-
I (ARG 1) ELISA kit).
11

Результаты выражали в нг/мл.

Статистическая обработка

результатов экспериментов

произведена с
помощью стандартной программы Statistica
10.0. По каждому параметру
определяли среднее арифметическое значение показателя и стандартную
ошибку средней величины.

Для определения и исключения «выскакивающих»
вариант в выборке использовали критерий Шовене

и правило «трех сигм»

(Сепетлиев Д.А., 1968
)
.
Для анализа отличий между экспериментальными
группами использовали
критери
й

Стьюдента

и

непараметрический критерий
Манни
-
Уитни
.

Различия между сравниваемыми показателями считали
достоверными при p<0,05.


Всего в работе было использовано
587

животных.


РЕ
ЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показатели состояния печени белых крыс, подвергнутых
а
нтенатальной гипоксии

АНГ

оказыва
ла

выраженное повреждающее влияние
на
печень
новорожденных и половозрелых
крыс
. У 7
-

и 60
-
суточных животных,
перенесших

АНГ
, была с
нижена

абсолютная масса печени

на
19,2% и
15,4
%


соответственно
. У 60
-
суточных
подопытных
животных

также

была снижена

относит
ельная

м
асса

печени на 4,7%

(таблица 1)
.

Это соответствует да
нным
литературы о наличии структ
урного дефицита жизненно важных органо
в у
животных, перенесших АНГ

(
Марковский В.Д. и соавт.,

2015
;

Сазонова Е.Н. и
соавт., 2011; Iqbal W., Ciriello J., 2013).


У 7
-
суточных

животных
, перенесших АНГ, имело место
снижение
ИМЯ
гепатоцитов
в 1,77 раза
, что свидетельствует об угнете
нии процессов с
интеза
ДНК.

Т
акже
выявлено

уменьшение
количества ядрышек в ядрах гепатоцитов
подопытных 7
-
суточных животных
на 10,1%
;
у 60
-
суточных животных




на

11,9% (Т
аблица 1)
.
У 60
-
суточных подопытных животных было
зарегистрировано

уменьшение суммарно
й площади ядрышек на 19,85%.
И
зменени
е

параметров ядрышкового аппарата
свидетельств
уе
т
о снижении

белок
-
синтетической активности гепатоцитов
животных
, перенесших АНГ
.
М
орфометрическ
ий анализ
гепатоцитов 60
-
суточных животных, перенесших
12

АНГ,
показал

уменьше
ние
площади

клеток на 20,45% и пло
щади ядер
гепатоцитов на 16,13%
,
по сравнению с контролем (Т
аблица
1
)
.

Показатель
доли двуядерных гепатоцитов у
60
-
суточных
животных подопытной группы
был на 48,9%

выше показателей группы контро
ля. Э
то может
свидетельствов
ать о нарушении процесса цитокинеза

или

о компенсаторной
реакции, направленной на сохранение функционирования органа в условиях
структурного дефицита

(
Саркисов Д.С.,1987)
.


Таблица 1


Морфологические

показатели печени
белых
крыс,
подвергнутых антенатально
й гипоксии


Показатель

Контроль

Антенатальная
гипоксия

7
-
суточные животные

Абсолютная масса печени, мг

420,56
+
20,76

339,78
+
18,00*

Относительная масса печени,

%

2,89
+
0,11

3,15
+
0,13

Индекс меченн
ых

3
Н
-
тимидином ядер (ИМЯ), %

2,37
+
0,44

1,34
+
0,26*

Интен
сивность метки (ИМ)

10,78
+
0,50

10,39
+
0,57

Количество ядрышек

2,07
+
0,04

1,86
+
0,06*

60
-
суточные
крысы
-
самцы

Абсолютная масса печени, мг

5682,86
+
278,21

4808,42
+
139,41*

Относительная масса печени,

%

3,82
+
0,07

3,65
+
0,03*

Площадь гепатоцитов, мкм
2

1394,84
+
82,41

1109,63
+
66,70*

Площадь ядер,
мкм
2

192,58
+
13,62

161,51
+
5,88*

Количество ядрышек

3,27
+
0,08

2,88
+
0,13*

П
лощадь ядрышек,
мкм
2

7,42
+
0,34

5,95
+
0,29*

Доля
2
-
ядерных гепатоцитов, %

23,13
+
1,85

34,44
+
3,76*

Примечания

-


*
-

р < 0,05 п
о отношению к гру
ппе «Контроль»

Выявленные структурные изменения у подопытных животных
сопровождались
окислительным

стрессом на органном и
системном уровнях
.

У
7
-
суточных
белых крыс группы «Антенатальная гипоксия»

мы
зарегистрировали интенсификацию процессов свободнорадика
льного
окисления
и ослабление антиоксидантной защиты
в гомогенатах печени;

у 60
-
суточных крыс
-
самцов
, пе
ренесших АНГ
,


в

гомогенатах печени и сыворотке
кр
ови (таблица

2
)
.

Анализ биохимических
параметров

сыворотки крови
, характеризующих
13

функци
ональное сост
ояние

печени,
у
60
-
суточных животных, перенесших
АНГ,

не выявил изменений.

Показатели
активности
аланинаминотрансфераз
ы
,
аспартатаминотрансферазы,

γ
-

г
лутамилтрансферазы, лактатдегидрогеназы,
щелочной фосфатазы
;

концентрации общего билирубина

и аргиназы
-
I

сыворотки крови

не отличались от показателей группы «Контроль».


Таким образом,
а
нтенатальная гипоксия вызывает нарушения
пролиферативных, анаболических и свободнорадикальных процессов в печени
белых крыс, сохраняющи
е
ся,
как минимум
, до половозрелого

возр
аста.


Морфологические показатели печени белых крыс, подвергнутых
введению аналогов лей
-
энкефалина в раннем периоде постнатального
онтогенеза

Введение неселективного агониста δ
-

-
ОР

пептида даларгин с 2 по 6
сутки жизни не влияло на гравиметрические пок
азатели 7
-
суточных
животных.
Показатели ДНК
-
синтетической активности гепатоцитов
после введения

даларгина также оставались без изменений. Было зарегистрировано повышение
количества ядрышек в ядрах гепатоцитов на 15% после пятикратного введения
даларгина.

У 60
-
суточных крыс
-
самцов, подвергнутых в раннем постнатальном
периоде введению даларгина,
не было
изменений массы тела, абсолютной

массы печени и морфометрических параметров гепатоцитов. При этом
было
зарегистрировано

снижение относительной массы печени н
а 8,45% и
увеличение доли двуядерных гепатоцитов в популяции клеток на 34,75
%
у
подопытных животных по сравнению с группой контроля
.

Таким образом,
неонатальное введение даларгина

приве
ло к стимуляции ядрышкового аппарата
гепатоцитов у 7
-
суточных животных
и увеличению количества двуядерных
гепатоцитов у 60
-
суточных животных.


Пяти
кратно
е введение

НАЛЭ с 2 по 6 день жизни белым крысам
не
влияло
на исследуемые показатели

7
-
суточных животных.
У 60
-
суточных крыс
-
самцов,
подвергнутых в раннем постнатальном перио
де введению

НАЛЭ,
гравиметрически
е

показател
и
, показател
и

количества

и

размеров
ядрышек
14

гепатоцитов не отличались от контроля.


Было зарегистрировано
увеличение
размеров
гепатоцитов на 35,5%

и
их ядер
на 29,7%.

Таким образом, у 60
-
суточных животных, подвер
гнутых в неонатальном периоде онтогенеза
введению пептида НАЛЭ, имели место морфологические признаки
гипертрофии гепатоцитов.

В целом, введение в неонатальном периоде

аналогов лей
-
энкефалина
, как
имеющих аффинность к ОР (даларгин), так и не связывающихся с

ОР (НАЛЭ)
вызывало
сходные эффекты
,

преимущественно

анаболической направленности
.


Показатели состояния печени белых крыс, подвергнутых
антенатальной гипоксии и неонатальному введению аналогов

лей
-
энкефалина

П
ятикратное введение даларгина с 2 по 6 сутки

жизни отменяло
негативное влияние
АНГ

на гравиметрические показатели, параметры
ДНК
-
синтетической
активности гепатоцитов (ИМЯ) и количество ядрышек в ядрах
гепатоцитов у 7
-
суточных
животных (Таблица 3).


Пятикратное введение НАЛЭ с 2 по 6 сутки жизни не к
орректировало
гравиметрических показателей и показателей ядрышкового аппарата
гепатоцитов 7
-
суточных животных, подвергнутых антенатальному
гипоксическому воздействию. У крыс группы «АНГ+НАЛЭ» масса тела,
абсолютная масса печени и количество ядрышек гепатоц
итов оставались
достоверно ниже контрольных параметров (Таблица 3). Вместе с тем, введение
пептида НАЛЭ нивелировало индуцированное АНГ угнетение ДНК
-
синтетической активности гепатоцитов 7
-
суточных животных. Более того,
средний показатель ИМЯ в печени подо
пытных животных достоверно превышал
контрольный показатель в 1,49 раза (Таблица 3).

При анализе показателей свободнорадикального окисления в гомогенатах
печени 7
-
суточных животных группы «АНГ+даларгин» мы зарегистрировали
нормализацию показателя амплитуды

Н2, характеризующей резистентность к
перекисному окислению (Таблица 2). Остальные параметры
хемилюминесценции оставались выше контрольных показателей, но были ниже
15

показателей группы «АНГ». Изменения показателей свободнорадикального
окисления в группе «АН
Г+НАЛЭ» были сходными.

Таким образом, хемилюминесцентное исследование гомогенатов печени
7
-
суточных животных, перенесших антенатальную гипоксию и получавших в
неонатальном периоде пептиды, выявило уменьшение выраженности
окислительного стресса и увеличение

активности антиоксидантной защиты на
органном уровне, по сравнению с животными, не получавшими пептидной
коррекции.

Результаты проведенного исследования показали, что неселективный
агонист δ
-

-
ОР пептид даларгин нивелирует негативное влияние АНГ на
грави
метрические и морфологические показатели печени новорожденных
белых крыс и существенно снижает выраженность окислительного стресса на
органном уровне. НАЛЭ вызывает частичную коррекцию негативных
последствий АНГ у 7
-
суточных животных.

У 60
-
суточных крыс
-
са
мцов группы «АНГ+даларгин» сохранялся
дефицит массы тела (Таблица 3). В группе «АНГ+НАЛЭ» соматометрические
показатели не отличались от группы «Контроль». Неонатальное введение
даларгина и НАЛЭ нивелировало уменьшение размеров гепатоцитов и
суммарной площа
ди ядрышек у 60
-
суточных крыс
-
самцов, перенесших АНГ
(Таблица 3).

У 60
-
суточных животных, перенесших АНГ, неонатальное введение
даларгина приводило к снижению выраженности окислительного стресса на
органном уровне и на уровне организма в целом. Показатели

ХМЛ в
гомогенатах печени и сыворотке крови 60
-
суточных животных группы
«АНГ+даларгин» оставались выше контрольных параметров, однако эти

показатели были ниже параметров группы «АНГ» (Таблица 2).
Применение
НАЛЭ в неонатальном периоде полностью отменяло не
гативное влияние АНГ
на свободнорадикальные процессы в печени 60
-
суточных крыс (Таблица 2).


16

Таблица 2
-

Показатели
хемилюминесценции гомогенатов печени и сыворотки крови белых крыс

исследуемых групп

Ткань/возраст

Группы

S
сп
,

отн. ед

Инд. ХМЛ (
Fe
2+
)

Инд.

ХМЛ (люминол
-
Н
2
О
2
)

Н1
,

отн.ед

Sинд1
,
отн.ед

Н2
,

отн.ед

Sинд2
,

о
тн.ед


ПЕЧЕНЬ

7
-
суточные

животные

Контроль

1,32
+
0,07

1,17
+
0,09

3,27
+
0,11

4,30
+
0,27

8,18
+
0,36

АНГ

2,78
+
0,12*

2,76
+
0,12*

6,83
+
0,30*

13,39
+
0,55*

17,22
+
0,51*

АНГ+Даларгин

1,79
+
0,09* #

1,7
8
+
0,15* #

4,94
+
0,34* #

5,10
+
0,35 #

9,47
+
0,33* #


7
-
суточные

животные

Контроль

1,86
+
0,16

1,96
+
0,12

5,91
+
0,49

6,73
+
0,48

10,53
+
0,77

АНГ

5,57
+
0,46*

5,99
+
0,27*

9,53
+
0,55*

17,66
+
0,64*

23,32
+
1,14*

АНГ+НАЛЭ

3,91
+
0,18*
#

4,07
+
0,25*#

7,78
+
0,42*#

13,55
+
1,04*#

16,
63
+
1,15*#


60
-
суточные

животные

Контроль

1,84
+
0,29

1,93
+
0,26

5,20
+
0,86

5,88
+
0,97

10,26
+
1,87

АНГ

4,94
+
0,48 *

5,37
+
0,61*

10,55
+
1,16*

16,90
+
1,83*

24,94
+
3,71*

АНГ+Даларгин

2,31
+
0,44*
#

2,64
+
0,52*
#

7,10
+
0,62*
#

12,99
+
1,86*

#

15,30
+
2,82*
#

АНГ+НАЛЭ

2,02
+
0,64
#

2,27
+
0,55 #

5,65
+
0,85 #

6,24
+
0,24 #

11,21
+
1,44 #


КРОВЬ

60
-
суточные

животные

Контроль

0,19
+
0,02

0,14
+
0,01

0,47
+
0,03

1,75
+
0,09

2,01
+
0,15

АНГ

0,49
+
0,03*

0,48
+
0,02*

1,16
+
0,07*

3,93
+
0,28

*

5,70
+
0,39*

АНГ+Даларгин

0,36
+
0,02* #

0,30
+
0,03* #

0,81
+
0,0
5* #

2,96
+
0,21* #

4,72
+
0,27* #

АНГ+НАЛЭ

0,28±0,02 *
#

0,22±0,02*#

0,62±0,05*#

2,16±0,10*#

3,50±0,15*#

Примечание

-

*
-

p


0,05 по отношению к группе «Контроль»; #
-

p

< 0,05 отношению к группе «Антена
т
альная
гипоксия»

17

Т
аблица
3



М
орфологические по
казатели 7
-

и 60
-
суточных белых крыс, подвергнутых антенатальной
гипоксии и неонатальному введению пептидов даларгин и НАЛЭ

Показатель

Контроль

АНГ

АНГ+
д
аларгин

АНГ + НАЛЭ

7
-
суточные

животные

Масса тела, г

16,07
+
0,61

10,83
+
0,91*

14,46
+
2,01

11,21
+
1,14*

А
бсолютная масса печени, мг

503,7
5
+
13,75

367,13
+
20,42*

512,86
+
54,06

394,25
+
40,81*

Относительная

масса печени, %

3,16
+
0,12

3,46
+
0,15

3,70
+
0,19

3,51
+
0,12

Индекс меченных
3
Н
-
тимидином ядер, ИМЯ, %

2,37
+
0,44

1,34
+
0,26*

2,20
+
0,34

3,54
+
0,35*

Интенсивность мет
ки (ИМ)

10,78
+
0,50

10,39
+
0,57

10,97
+
0,48

13,23
+
1,09

Количество ядрышек
в ядрах гепатоцитов

2,73
+
0,04

2,56
+
0,04*

2,62
+
0,05

2,31
+
0,08*

60
-
суточные

животные

Масса тела, г

281,67±
9,20

249,44
+
7,97*

256,18
+
5,90*

274,33
+
9,69

Абсолютная масса печени, г

11,10
+
0
,72

10,07
+
0,58

10,55
+
0,45

11,15
+
0,70

Относительная масса печени,

%

3,95
+
0,11

4,01
+
0,13

4,09
+
0,11

3,73
+
0,40

Площадь гепатоцитов,

мкм
2

809,15
+
19,21

746,69
+
11,39*

882,34
+
30,28*

884,17
+
64,15

Площадь ядер

гепатоцитов
,
мкм
2

98,734
+
2,96

92,77
+
3,03

99,52
+
2,21

101,34
+
3,35

Количество ядрышек
в ядрах гепатоцитов

2,26
+
0,09

2,05
+
0,13

2,51
+
0,10

2,49
+
0,15

Суммарная площадь ядрышек, мкм
2

7,424
+
0,34

5,95
+
0,29*

7,02
+
0,35

6,34
+
0,32

Доля двуядерных гепатоцитов, %

22,8
+
2,05

18,70
+
0,70

24,55
+
1,10

25,00
+
1,36

Примечание

-

*
-

p

< 0,05 по отношению к группе «Контроль»

18

П
оказатели ХМЛ гомогенатов печени 60
-
суточных
животных группы
«АНГ+НАЛЭ»

не отличались от

показателей
группы

«Контроль»
.

Это
свидетельствует о выраженном корригирующем влиянии неонатального
введения НАЛЭ

на от
даленные последствия АНГ
.


Таким образом, а
гонист
ОР
даларгин и неопиатный аналог лей
-
энкефалина
пептид НАЛЭ
оказывали однонаправленные корригирующие
влияния на негативные ранние и отдаленные последствия антенатальной
гипоксии в печени.

У 7
-
суточных животн
ых даларгин оказывал более
выра
женное, чем НАЛЭ,
нормализующее влияние на состояние печени. По
-
видимому, аффинность к
ОР
является важной частью механизмов
гепатопротективного влияния пептидов в раннем постнатальном периоде
.

У 60
-
суточных животных НАЛЭ ока
зывал более выраженное корректирующее
влияние на состояние печени. Механизмы долгосрочных эффектов НАЛЭ
требуют дальнейшего исследования
.

Результаты проведенного исследования показывают эффективность
неонатального применения пептидов даларгин и НАЛЭ для к
оррекции
негативных влияний АНГ на состояние печени млекопитающих. Неопиатный
аналог лей
-
энкефалина представляет особый интерес, как перспективное
средство для коррекции негативных
влияний

АНГ.


ВЫВОДЫ

1.

У 7
-
суточных белых крыс, перенесших антенатальную гипо
ксию, имеет
место активация свободнорадикального окисления в ткани печени,
сопровождающаяся угнетением пролиферативной и белок
-
синтетической
активности гепатоцитов.

2.

У 60
-
суточных белых крыс, перенесших антенатальную гипоксию,
сохраняются проявления окисли
тельного стресса на тканевом и системном
уровне; при этом регистрируются уменьшение площади гепатоцитов и их ядер,
а также признаки угнетения
белок
-
синтетической

активности гепатоцитов
(уменьшение к
оличества и размеров ядрышек).

19

3.

Введение новорожденным жив
отным с 2 по 6 сутки жизни агониста δ/µ
-
опиатных рецепторов пептида даларгин приводит к активации ядрышкового
аппарата гепатоцитов
у
7
-
суточных животных и увеличению количества
двуядерных гепатоцитов у 60
-
суточных крыс
-
самцов.

4.

Введение неопиатного аналога
лей
-
энкефалина с 2 по 6 сутки жизни в
дозе 100 мкг/кг не влияет на исследуемые параметры печени 7
-
суточных белых
крыс и приводит к увеличению средней площади гепатоцитов, средней
площади ядер гепатоцитов и доли двуядерных гепатоцитов у 60
-
суточных
крыс
-
сам
цов.

5.

Неонатальное введение агониста δ/µ
-
опиатных рецепторов пептида
даларгин

животным, перенесшим антенатальную гипоксию, уменьшает
выраженность окислительного стресса и нормализует структурные показатели
печени 7
-
суточных белых крыс. Корректирующий эффек
т неонатального
введения неопиатного аналога лей
-
энкефалина у 7
-
суточных животных,
перенесших антенатальную гипоксию, выражен существенно меньше.

6.

Неонатальное введение агониста δ/µ
-
опиатных рецепторов пептида
даларгин частично корректирует последствия анте
натальной гипоксии у
60
-
суточных животных:
регистрируется увеличение размеров гепатоцитов на фоне
уменьшения выраженности окислительного стресса на тканевом и системном
уровне.

7.

Неонатальное введение неопиатного аналога лей
-
энкефалина нивелирует
последстви
я антенатальной гипоксии у 60
-
суточных животных. Неопиатный
аналог лей
-
энкефалина является перспективным средством коррекции ранних и
отдаленных постгипоксических изменений гепатоцитов у млекопитающих
.


20

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТ
АЦИИ

Публикации в изданиях рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ
:

1.

Влияние антенатальной гипоксии на некоторые показатели тканевого
гомеостаза печени белых крыс /

О. Г.
Пинаева, О. А. Лебедько, Д. В. Яковенко,
С. С. Тимошин, С. К. Пинаев, Е. Н. Сазонова // Бюлл.

эксп
ерим
. биол. и мед.


2014.

Т. 157, № 3.


С. 301
-
304.

2.

Пинаева, О. Г. Влияние опиоидных пептидов на некоторые показатели
тканевого гомеостаза печени новорожденных белых крыс / О. Г.Пинаева, О. А.
Лебедько, Е. Н. Сазонова //

Дальневост. медицин. журна
л.
-

2014.
-

№ 2.
-

С. 79
-
83.

3.

Коррекция пептидами семейства опиоидов негативного влияния
антенатальной гипоксии на тканевой гомеостаз печени новорожденных белых
крыс / О. Г. Пинаева, Е. Н. Сазонова, О. А. Лебедько, С. С. Тимошин // Бюлл.
эксп
ерим
. биол. и
мед.


2016.


Т. 162, № 8.


С. 165
-
168.

4.

Влияние неонатального введения даларгина на морфометрические
показатели гепатоцитов и свободнорадикальное окисление в организме белых
крыс, перенесших антенатальную гипоксию /

О. Г.
Пинаева, О. А. Лебедько, С.
К. П
инаев, Е. Н. Сазонова // Дальневост. медицин. журнал.
-

2017.
-

№ 3.
-

С.
67
-
71.


Работы, опубликованные в
сборниках трудов и материалах

международных конференций
,

конференций с международным
участием:

5.

Яковенко, Д. В. Влияние дигидрокверцитина на некоторые

показатели
структурного гомеостаза различных клеточных популяций белых крыс /

Д. В.
Яковенко, А. А. Симанкова, О. Г. Пинаева

//

Актуальные вопросы современной
медицины: материалы 70
-
й итоговой научной конференции молодых ученых и
студентов ДВГМУ с междун
ародным участием.


Хабаровск, 2013.
-

С. 36
-
40


21

6.

Пинаева, О. Г. Отдаленные эффекты неонатального введения
синтетических аналогов лей
-
энкефалина на показатели тканевого гомеостаза
печени половозрелых белых крыс / О. Г. Пинаева, Е. Н. Сазонова //
«
Актуальные

вопросы медицины» VI Ежегодная Международная Научно
-
Практическая Конференция, 10
-
11 мая 2017 г.
-

Баку, 2017.
-

С. 156.

7.

Пинаева, О. Г. Влияние хронической антенатальной гипоксии на
некоторые показатели тканевого гомеостаза печени белых крыс /

О. Г.
Пинаев
а,
О. А. Лебедько, Е. Н. Сазонова // Актуальные вопросы неонатологии и
педиатрии: сборник научных трудов Дальневосточной научно
-
практической
конференции с международным участием.
-

Хабаровск, 2017.


С. 102
-
103.


Работы, опубликованные в сборниках трудов и

материалах
региональных конференций:

8.

Влияние дигидрокверцетина на анаболическую активность гепатоцитов
новорожденных белых крыс /

Е. Н. Сазонова, О. Г. Пинаева, М. А. Ивасюк, О.
В. Дещеня, Д. В. Яковенко //

Теоретические, экспериментальные и
практические

основы формирования регионального рынка БАДов: материалы
региональной научно
-
практической конференции ДВГМУ.
-

Хабаровск, 2013.
-

С. 41
-
45.

9.

Пинаева, О. Г. Морфологический подход к анализу структурного следа
хронической внутриутробной гипоксии в печени млек
опитающих
(экспериментальные исследования) / О. Г.Пинаева, О. А. Лебедько, Е. Н.
Сазонова //

Современные лабораторные технологии: Cборник научных трудов
научно
-
практической конференции по лабораторной диагностике, посвященной
155
-
летию со дня образования г
орода Хабаровска.


Хабаровск, 2013.
-

С. 50
-
56.

10.

Влияние дигидрокверцитина на структурный гомеостаз различных
клеточных популяций новорожденных белых крыс /
Д. В.
Яковенко, А. А.
Симанкова, О. Г. Пинаева, Е. Н.
Сазонова //

Актуальные вопросы
эксперименталь
ной биологии и медицины: материалы I региональной научной
конференции ДВГМУ.


Хабаровск, 2014.
-

С. 61
-
65.

22

11.

Пинаева, О. Г. Влияние неопиатного аналога лей
-
энкефалина на
некоторые показатели тканевого гомеостаза печени белых крыс / О. Г. Пинаева,
Е. Н. Сазо
нова, Е. А. Варавина // Актульные вопросы экспериментальной
биологии и медицины: материалы I региональной научной конференции
ДВГМУ.


Хабаровск, 2014.
-

C
. 34
-
38.

12.

Отдаленные структурные последствия антенатальной гипоксии / Е. Н.
Сазонова, А. А. Симанкова,

О. Г. Пинаева, С. И. Зубенко //

Актуальные
вопросы экспериментальной биологии и медицины: материалы II региональной
научной конференции ДВГМУ.


Хабаровск, 2015.


С. 42
-
49

13.

Пинаева, О. Г. Коррекция ранних и отдаленных последствий
антенатальной гипоксии дл
я тканевого гомеостаза печени с помощью
регуляторных пептидов группы опиоидов /

О. Г.
Пинаева, О. А. Лебедько, Е. Н.
Сазонова // Актуальные вопросы экспериментальной биологии и медицины:
материалы
III

региональной научной конференции ДВГМУ, посвященной
пам
яти заслуженного деятеля науки РФ С.С. Тимошина.


Хабаровск, 2017.

С.
45
-
55.


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АНГ
-

а
нтенатальная гипоксия

ИМ


интенсивность метки

ИМЯ


индекс меченых ядер

НАЛЭ
-

неопиатный аналог лей
-
энкефалина

ОП


опиоидные пептиды

ОР
-

опиатные

рецепторы

СРО


свободнорадикальное окисление

ХМЛ


хемилюминесценция

ЯОР


ядрышкообразующие районы хромосом

δ/µ
-

ОР


дельта
/мю
-
опиатные рецепторы




23






















Подписано в печать 22 января 2018

г
. Формат

60
x
84
/16
.

Бумага офсетная.
Усл.
п
еч
. л.
1,0

Тираж 100 экз. Заказ


1


Издательство ФГБОУ ВО ДВГМУ.

680000, г. Хабаровск, ул.
Пушкина
, 3
1.


Отпечатано в типографии издательства ФГБОУ ВО ДВГМУ.

680000, г. Хабаровск, ул. Муравьева
-
Амурского, 35.



Приложенные файлы

  • pdf 87662817
    Размер файла: 391 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий